基于腸道菌群的丹參-紅花藥對(duì)抗心肌缺血機(jī)制探討
Mechanism of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Carthami Flos Drug Pairs Against Myocardial Ischemia Based on Intestinal Bacteria
王小平,杜少兵,白吉慶,周慧慧,李 菁,權(quán)利娜,王鵬飛
（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院）
*國(guó)家自然科學(xué)基金［81974544］；陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目［2019SF-286］；陜西省教育廳重點(diǎn)科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目［18JS025］
摘要
目的：探討丹參-紅花藥對(duì)抗心肌缺血的機(jī)制。方法：將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組，等體積純凈水）、模型組（B組，等體積純凈水）、復(fù)方丹參滴丸組（C組，73mg/kg）及丹參-紅花低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，原藥材4，8，16g/kg），各10只，各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物或純凈水，每天1次，連續(xù)7d。于第6天、第7天灌胃給藥1h后，除A組外，其余各組均皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（85mg/kg）以復(fù)制急性心肌缺血大鼠模型。觀察大鼠心肌病理形態(tài)、心肌細(xì)胞凋亡情況，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠心肌酶水平；采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法計(jì)算各組總效應(yīng)值和偏最小二乘回歸分析（PLS-DA）得分，篩選效果最佳的劑量組進(jìn)行腸道菌群多樣性分析。結(jié)果：D3組的綜合指數(shù)最高（7.68），其次是D2組（7.18），D3組和D2組PLS-DA得分差異較小，選用D2組進(jìn)行腸道菌群多樣性分析；與B組比較，D2組放線菌門、TM7菌門、厚壁菌門/擬桿菌門、乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53菌屬的相對(duì)豐度顯著升高（P<0.05或P<0.01），擬桿菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、顫螺菌屬和羅斯氏菌屬的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：丹參-紅花藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。
關(guān)鍵詞：丹參 - 紅花藥對(duì)；急性心肌缺血；大鼠；鹽酸異丙腎上腺素；病理形態(tài)學(xué)；心肌細(xì)胞凋亡；心肌酶；腸道菌群；16S rRNA 基因測(cè)序
Key words：Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Carthami Flos drug pairs；acute myocardial ischemia；rat；isoproterenol hydrochloride；pathomorphology；cardiomyocyte apoptosis；myocardial enzyme；intestinal bacteria；16S rRNA gene sequencing
中圖分類號(hào)：R972；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A
國(guó)家心血管病中心《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019》指出，中國(guó)現(xiàn)有心血管疾病患者3.30億，其中心肌梗死約250萬(wàn)，且患病率持續(xù)上升，而心肌缺血是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要原因。丹參-紅花屬活血化瘀藥對(duì)，療效確切，廣泛存在于具有活血化瘀功效的中成藥（如丹紅注射液、丹紅化瘀口服液、心寧片等）中。腸道菌群與多種疾病密切相關(guān)，推測(cè)丹參-紅花藥對(duì)抗心肌缺血可能與腸道菌群有關(guān)。為此，本研究中采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)，分析丹參-紅花藥對(duì)對(duì)急性心肌缺血模型大鼠腸道菌群豐度和不同分類水平的影響，探討該藥對(duì)抗心肌缺血的作用與腸道菌群調(diào)節(jié)的密切關(guān)系，為闡明其抗心肌缺血的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為缺血性心臟病的防治提供有效的藥物治療靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
儀器：RM2235型切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)<上海>有限公司）；QH01-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DP73型顯微鏡（奧林巴斯<北京>銷售服務(wù)有限公司）；KQ-400KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；EXPERT18K-R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙市鑫奧儀器儀表有限公司）；XSE105型分析天平（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，精度為0.01mg，0.1mg）；Nano Drop NC2000型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher公司）；BG-gds‐AUTO（130）型凝膠成像系統(tǒng)（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；DYY-6C型瓊脂糖電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；2720型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；NovaSeq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）；FLX800T型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。
試藥：鹽酸異丙腎上腺素（ISO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為P1794259）；蘇木精（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為H8070）；醇溶性伊紅Y（批號(hào)為A600190，生工生物工程<上海>股份有限公司）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢默沙克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為kt22023）；肌酸激酶同工酶（CK）ELISA試劑盒（上海邦奕商貿(mào)有限公司，批號(hào)為DRE20781）；大鼠CK-MB ELISA試劑盒（上海科順生物科技有限公司，批號(hào)為KS12296）；大鼠乳酸脫氫酶（LDH）ELISA試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號(hào)為kt30149）；大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒（美國(guó)Burlingame公司，批號(hào)為kt30311）；瓊脂糖凝膠（批號(hào)為75510-019）、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液（批號(hào)為AM9870）、NovaSeq6000SP500cyclesReagentKit（批號(hào)為20012866）、Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit（批號(hào)為P7589），均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Marker（日本寶生物股份有限公司，批號(hào)為DL1500/DL2000）；Q5?High-FidelityDNA聚合酶（紐英倫生物技術(shù)<北京>有限公司，批號(hào)為M0491L）；MagPureSoilDNALQKit（廣州美基生物科技有限公司，批號(hào)為D6356-03）；水為純凈水。丹參及紅花藥材均購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定為真品。
動(dòng)物：健康SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-030。在溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度50%±10%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)TCM-2018-030-E01）。
1.2 方法
1.2.1 丹參-紅花藥對(duì)有效物質(zhì)的提取及質(zhì)量控制
提取：取丹參飲片300g，紅花飲片100g，加8倍量的水浸泡1h，溫（45℃）浸2h，取出，放冷至室溫，濾過(guò)，濾渣加8倍量水，再提取2次（每次2h），濾過(guò)，濾液合并，減壓濃縮至250mL（即相當(dāng)于原藥材每1mL含1.6g）。實(shí)驗(yàn)高、中、低劑量分別為原藥材1.6，0.8，0.4g/mL。
質(zhì)量控制：精密吸取含原藥材0.4g/mL的溶液6mL，置10mL容量瓶中，加水定容，采用高效液相色譜法測(cè)定。結(jié)果丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的質(zhì)量濃度分別為0.05，0.22，0.026，0.029，0.075，0.70mg/mL。
1.2.2 分組、給藥與復(fù)制模型
將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組，等體積純凈水）、模型組（B組，等體積純凈水）、復(fù)方丹參滴丸組（C組，73mg/kg）及丹參-紅花低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，相當(dāng)于原藥材4，8，16g/kg），各10只。各組大鼠灌胃給予相應(yīng)純凈水或藥物，每天1次，連續(xù)7d。于第6天、第7天灌胃1h后，除A組外，其余各組大鼠皮下注射ISO（85mg/kg），選擇5次心率計(jì)算ST段偏移電壓的平均值，ST段向上或向下偏移超過(guò)0.1mV即為復(fù)制急性心肌缺血大鼠模型成功。
1.2.3 藥效學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
心肌病理形態(tài)：采用HE染色法。處死大鼠，取出心臟，固定，石蠟包埋、切片，脫蠟，以蘇木素染色。采用1%鹽酸酒精分化，以自來(lái)水返藍(lán)，伊紅染色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察大鼠心肌病理形態(tài)。
心肌細(xì)胞凋亡情況：采用TUNEL染色法。取出心臟，組織固定，石蠟包埋、切片，脫蠟，組織透化，過(guò)氧化氫封閉，酶標(biāo)記，POD標(biāo)記，DAB顯色，復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。
心肌酶：采用ELISA法。在末次注射ISO 12h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，待凝固30min后常規(guī)離心，取血清。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，計(jì)算大鼠血清中AST，CK，CK-MB，LDH，cTnI活性或含量。
1.2.4 藥效綜合評(píng)分及效應(yīng)評(píng)價(jià)
采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率、AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI 6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)化處理，計(jì)算丹參-紅花藥對(duì)抗心肌缺血的總效應(yīng)值。當(dāng)B組指標(biāo)數(shù)值高于A組時(shí)，V標(biāo)化=（V模型?V給藥）/V模型；當(dāng)B組指標(biāo)數(shù)值低于A組時(shí)，V標(biāo)化=（V給藥-V模型）/V模型，式中V為各指標(biāo)數(shù)值。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和臨床實(shí)際檢測(cè)和衡量心肌缺血的指標(biāo)，確定上述6個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要性，再利用變量投影重要性（VIP）定義各指標(biāo)的權(quán)重，抗心肌缺血總效應(yīng)值即為6項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)化值乘以權(quán)重后的總和。采用Simca軟件計(jì)算各指標(biāo)的VIP值，依據(jù)VIP值的大小判斷各個(gè)指標(biāo)對(duì)總體結(jié)果的重要程度，通常VIP>1的指標(biāo)貢獻(xiàn)較大。
將所有指標(biāo)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-P11.5軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)降維處理，建立包含第1個(gè)主成分t與第2個(gè)主成分t的PLS-DA得分圖，得分圖的空間坐標(biāo)就是各樣本在第1個(gè)主成分和第2個(gè)主成分構(gòu)成的平面上的投影得分值，可直觀反映組間的相似或差異性，樣本的坐標(biāo)點(diǎn)在得分圖上的位置越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣本間的差異越明顯，反之亦然。根據(jù)組間樣本坐標(biāo)點(diǎn)位置的遠(yuǎn)近，獲取組間差異信息。結(jié)合綜合評(píng)分和PLS-DA法的效應(yīng)評(píng)價(jià)，從丹參-紅花高、中、低劑量組中選取療效最佳的一個(gè)組進(jìn)行腸道菌多樣性分析。
1.2.5 腸道菌群多樣性分析
細(xì)菌DNA抽提：以心臟HE染色結(jié)果為依據(jù)，每組篩選3只大鼠。取大鼠盲腸內(nèi)容物200mg，提取細(xì)菌總DNA，采用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查所提取DNA的完整程度。
DNA文庫(kù)構(gòu)建：PCR上游引物為338F，序列為5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，下游引物為806R，序列為5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR擴(kuò)增條件，98℃預(yù)變性3min；98℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，28個(gè)循環(huán)；最終擴(kuò)展延伸72℃5min。以Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光定量分析。根據(jù)結(jié)果，按樣本測(cè)序量需求，按相應(yīng)比例對(duì)樣本進(jìn)行混合。
測(cè)序：通過(guò)Illumina Novaseq-PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行2×250bp的雙端測(cè)序獲得的Paired-end（PE）reads，根據(jù)Fastq文件對(duì)測(cè)序樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，根據(jù)PEreads之間的overlap（最小overlap長(zhǎng)度為10bp）使用FLASH（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7）軟件拼接成1條序列，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾［采用fastx-toolkit工具過(guò)濾數(shù)據(jù)，僅保留高質(zhì)量（Q值≥25）的堿基比例≥90%的reads］，過(guò)濾后的序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP）作比對(duì)，用usearch64-bit軟件進(jìn)行嵌合體序列的檢測(cè)及過(guò)濾，去除已知序列的嵌合體，得到最終的優(yōu)化序列。基于優(yōu)化序列利用Uparse（http：//drive5.com/uparse/，version7.0.1090）進(jìn)行OTU聚類分析，基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析；基于Silva（如Release132，https：//www.arb-silva.de/docu‐mentation/release-132）參考數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)樣品的OTUs進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，基于分類學(xué)信息進(jìn)行物種結(jié)構(gòu)分析和物種差異分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以
±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 心肌病理形態(tài)
A組大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，染色均勻，細(xì)胞核染清晰，偶見(jiàn)心肌間質(zhì)散在炎性細(xì)胞。與A組比較，B組心肌間質(zhì)疏松、充血、腫脹，伴有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞溢出，心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞核固縮、碎裂。與B組比較，D3組和D2組，心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，偶見(jiàn)心肌間質(zhì)腫脹、充血，少量炎性細(xì)胞，紅細(xì)胞溢出；D1組，心肌間質(zhì)腫脹、充血，伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞溢出，心肌細(xì)胞核固縮，心肌纖維斷裂。詳見(jiàn)圖1。
2.2 心肌細(xì)胞凋亡情況
詳見(jiàn)圖2。B組、C組及D1組、D2組、D3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率分別為26.2%，12.0%，3.2%，3.5%，8.4%。
2.3 心肌酶水平
與A組比較，B組大鼠血漿LDH，CK，AST，CK-MB，cTnI水平顯著升高（P<0.01）；與B組比較，C組及D1組、D2組、D3組大鼠血漿LDH，CK，AST，CK-MB，cTnI水平顯著降低（P<0.01或P<0.05）。詳見(jiàn)圖3。
2.4 藥效綜合評(píng)分
檢索到近10年心肌缺血相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道1.6萬(wàn)篇，其中涉及心肌細(xì)胞凋亡，AST，LDH，CK，CK-MB，cTnI的數(shù)量分別為739篇、83篇、872篇、201篇、98篇、70篇；將所有指標(biāo)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Simca-P11.5軟件，可得到VIP值（圖4）。可見(jiàn)，LDH、心肌細(xì)胞凋亡率、CK指標(biāo)的VIP值均大于1，表明上述指標(biāo)對(duì)心肌缺血的影響相對(duì)重要；而AST，CK-MB，cTnI指標(biāo)的VIP值均小于1，表明其對(duì)心肌缺血的影響相對(duì)較小。再結(jié)合各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)（見(jiàn)表1），最終確定心肌細(xì)胞凋亡、LDH的權(quán)重系數(shù)為3，CK的權(quán)重系數(shù)為2，AST，CK-MB，cTnI的權(quán)重系數(shù)為1。
2.5 抗心肌缺血效應(yīng)評(píng)價(jià)（PLS-DA法）
A組與B組PLS-DA得分有顯著差異，表明建模成功；A組、C組及D1組、D2組、D3組差異較小，但兩類之間有顯著差異，表明C組及D2組、D3組大鼠急性心肌缺血狀態(tài)得到緩解；D2組、D3組部分重疊，表明差異較小。詳見(jiàn)圖5。
2.6 腸道菌群多樣性分析
Alpha多樣性：指局部均勻生長(zhǎng)環(huán)境下的物種在豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標(biāo)，其通過(guò)群落多樣性指數(shù)、群落均勻度指數(shù)與群落豐度指數(shù)等反映樣品的物種多樣性，以Chao1（Chao，1984）和Observedspe‐cies指數(shù)表征豐富度，以Shannon（Shannon，1948a，b）和Simpson（Simpson，1949）指數(shù)表征多樣性，以Pielou'sevenness（Pielou，1966）指數(shù)表征均勻度。與A組比較，B組Chao1，Observedspecies，Pielou，Shannon和Simpson指數(shù)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。與B組比較，D2組Chao1，Observedspeciess，Pielou，Shannon和Simpson指數(shù)顯著升高（P<0.05，P<0.01），表明丹參-紅花藥對(duì)可有效增加盲腸中菌群豐度、菌群多樣性和均勻度。詳見(jiàn)表2。
各組間菌群擴(kuò)增子序列變異（ASVs）或可操作的分類單元（OTU）數(shù)量明顯發(fā)生改變。豐度等級(jí)曲線是分析多樣性的一種方式，以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)（log2）或者用OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量為縱坐標(biāo)。該曲線用于解釋多樣性的物種豐度和物種均勻度2個(gè)方面。在水平（橫軸）方向，物種的豐度由曲線的長(zhǎng)度來(lái)反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻，曲線越陡峭，物種間的豐度差異越大。詳見(jiàn)圖6A。D2組橫軸上的折線較長(zhǎng)，表明其OTU數(shù)量較多。詳見(jiàn)圖6B。
Beta多樣性：該分析用于評(píng)估微生物群落間的差異。與A組比較，B組菌群結(jié)構(gòu)組成差異明顯，表明ISO誘導(dǎo)模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化；而D2組偏離B組，表明丹參-紅花藥對(duì)可改善ISO模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和菌群多樣性。詳見(jiàn)圖6C。
2.7 腸道菌群不同分類水平
門水平的腸道菌群組成：從各組樣品中鑒定出厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、軟壁菌門等16個(gè)菌門，厚壁菌門相對(duì)豐度最高，其次是擬桿菌門，厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度的比值（F/B）可在一定程度上反映機(jī)體的健康狀態(tài)。詳見(jiàn)圖7。與A組比較，B組大鼠腸道菌群放線菌門、TM7門的相對(duì)豐度和F/B顯著降低（P<0.05），擬桿菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門的相對(duì)豐度顯著升高（P<0.01）；與B組比較，D2組擬桿菌門、軟壁菌門和脫鐵桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.01），放線菌門、TM7門的相對(duì)豐度和F/B顯著升高（P<0.05），表明丹參-紅花藥對(duì)可調(diào)節(jié)失調(diào)的腸道菌群水平和菌群的組成，從而發(fā)揮抗心肌缺血作用。詳見(jiàn)圖8。
科、屬水平的腸道菌群組成：從3組樣品中共得到腸道菌在科水平、門水平排名前17位的科和屬水平組成，詳見(jiàn)圖9。與A組比較，B組大鼠腸道菌群中瘤胃菌科、擬桿菌科、理研菌科和艱難桿菌科相對(duì)豐度顯著升高（P<0.01）；與B組比較，D2組以上菌科相對(duì)豐度顯著降低（P<0.01）。詳見(jiàn)圖10。與A組比較，B組大鼠腸道菌群中顫螺菌屬和羅斯氏菌屬相對(duì)豐度顯著升高（P<0.05），乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53屬相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）；與B組比較，D2組顫螺菌屬和羅斯氏菌屬相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05），乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53菌屬相對(duì)豐度顯著升高（P<0.05）。表明丹參-紅花藥對(duì)可顯著調(diào)節(jié)急性心肌缺血模型大鼠腸道菌群。詳見(jiàn)圖11。
3 討論
本研究中以心肌病理、心肌細(xì)胞凋亡及心肌酶等指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法，計(jì)算總效應(yīng)值，評(píng)價(jià)高、厚壁菌門是腸道菌群的主要組成部分，其主要代謝產(chǎn)物為包括乙酸、丙酸和丁酸等在內(nèi)的短鏈脂肪酸，而短中、低劑量丹參-紅花藥對(duì)對(duì)模型大鼠心肌缺血的保護(hù)作用，結(jié)果可知，D3組>D2組>C組>D1組，由PLS-DA得分圖可知，D2組和D3組部分重疊，說(shuō)明差異較小，故選取D2組進(jìn)行腸道菌多樣性分析。結(jié)果表明，丹參-紅花藥對(duì)可顯著改善急性心肌缺血模型大鼠腸道中顫螺菌屬、羅斯氏菌、乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53菌屬的相對(duì)豐度，其抗心肌缺血作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)上述菌群實(shí)現(xiàn)的。
本研究結(jié)果表明，丹參-紅花藥對(duì)可一定程度上調(diào)節(jié)門分類水平菌群，主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門，顯著升高厚壁菌門的相對(duì)豐度和F/B（P<0.01），鏈脂肪酸可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，保護(hù)心肌缺血，說(shuō)明丹參-紅花藥對(duì)可能通過(guò)升高厚壁菌門的相對(duì)豐度和F/B改變腸道菌群的組成，促進(jìn)T細(xì)胞分化成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而達(dá)到保護(hù)模型大鼠心肌缺血的目的。
在屬水平，心肌缺血模型大鼠的乳桿菌屬相對(duì)豐度水平顯著降低，羅斯氏菌屬相對(duì)豐度水平顯著升高，與已有文獻(xiàn)結(jié)論一致。丹參-紅花藥對(duì)能升高心肌缺血模型大鼠腸道中乳桿菌屬相對(duì)豐度、SMB53菌屬、棒狀桿菌屬和葡萄球菌屬相對(duì)豐度，其中乳桿菌是維持腸道菌群平衡和健康的有益菌，可改善心肌梗死后的心臟重塑，還可通過(guò)谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸，抑制促炎性細(xì)胞因子減輕炎性反應(yīng)，起到心肌保護(hù)作用。此外，乳桿菌等益生菌可上調(diào)心肌缺血模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺和多巴胺的水平，說(shuō)明丹參-紅花藥對(duì)可能通過(guò)回調(diào)急性心肌缺血模型大鼠腸道益生菌的相對(duì)豐度來(lái)改善心肌缺血。
有研究表明，腸道菌群可通過(guò)參與色氨酸的代謝來(lái)影響CVD的發(fā)生與發(fā)展。大腸桿菌和乳桿菌等細(xì)菌中的色氨酸酶能將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚和吲哚-3-乙酸（IAA）等，IAA可減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)調(diào)節(jié)膽固醇和膽汁酸生物合成，減輕炎性反應(yīng)，而丹參-紅花藥對(duì)可升高急性心肌缺血模型大鼠腸道中乳桿菌屬相對(duì)豐度，說(shuō)明丹參-紅花藥對(duì)可能是通過(guò)升高乳桿菌屬的相對(duì)豐度，促進(jìn)IAA的生成，減輕炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)心肌缺血的作用。
綜上所述，丹參-紅花藥對(duì)的抗心肌缺血作用可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化增殖、色氨酸代謝途徑、抗炎作用有關(guān)，也可能與參與上述作用的相關(guān)菌群有關(guān)。本課題組后續(xù)將通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)差異菌群和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化增殖、色氨酸代謝途徑等可驗(yàn)證途徑進(jìn)行驗(yàn)證。本研究有助于探討丹參-紅花藥對(duì)抗心肌缺血的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
參考文獻(xiàn)：略。
作者簡(jiǎn)介：
第一作者：王小平，女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。
該文完整發(fā)布于《中國(guó)藥業(yè)》雜志2022年4月20日出版的第31卷第8期第30~36頁(yè)。
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