亚洲精品国产原创电影在线|人妻系列无码专区久久五月天|国产在线精品一区二区|久99视频精品免|国产精品V日韩精品v

目的：探討銀翹散對急性肺損傷（ALI）模型小鼠肺損傷的改善及作用機制。方法：將60只KM小鼠隨機分為陰性對照組、模型組、銀翹散組、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）組，各15只。銀翹散組灌胃給予銀翹散（按生藥和體質量計72.54g/kg），陰性對照組、模型組、DnaseⅠ組小鼠均灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續3 d。末次給藥30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，剝離皮下組織，暴露氣管，于氣管內滴注脂多糖（5 mg/kg），陰性對照組同法滴注生理鹽水，以復制ALI模型小鼠；DNaseⅠ組建模成功10min后同法滴注DNaseⅠ（5mg/kg）。6h后處死小鼠，取出肺組織，測定肺部濕/干重比（W/D）；采用免疫熒光法和蛋白免疫印跡法檢測髓過氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3）的表達水平；蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理形態。結果：與模型組比較，銀翹散組W/D顯著降低（P<0.05），MPO和CitH3的表達水平均顯著降低（P<0.05），氣道周圍及肺組織中的炎性細胞浸潤減輕。結論：銀翹散可通過抑制中性粒細胞胞外誘捕網形成中MPO和CitH3的表達水平，從而減輕小鼠ALI。

關鍵詞：銀翹散；中性粒細胞胞外誘捕網；急性肺損傷；作用機制；小鼠

Key words： Yinqiao Powder；neutrophil extracellular traps；acute lung injury；mechanism；mice

中圖分類號：R932;R285.5  文獻標志碼：A

1.1  儀器、試藥與動物

儀器：XS125A型分析天平（瑞士普利賽斯公司，精度為十萬分之一）；Infinite M200 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）；cf16RX型低溫高速離心機（日本HitachiKoki公司）；OSE-Y50型高速組織研磨器（天根生化科技<北京>有限公司）；Ti-S型倒置相差顯微鏡、Ci-L型正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；EG1150型石蠟包埋機、RM2235型手動輪轉式切片機（德國徠卡儀器有限公司）。

試藥：銀翹散組方藥材購自云南慈慧藥業有限公司，制備工藝參考文獻；脂多糖（美國Sigma公司，貨號為O111：B4，批號為019M4009V）；兔來源抗CitH3抗體（批號為GR-13294584），兔來源抗MPO抗體（批號為GR3243222-17），均購自英國Abcam公司；DAPI染料（批號為20200630），驢血清（批號為20200818），DN‐aseI（批號為20200630），均購自北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）山羊抗兔熒光抗體（批號為20000168），四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）山羊抗兔熒光抗體（批號為20000054），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批號為20000243），抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號為00083126），均購自美國ProteintechGroup公司。

動物：健康雄性KM小鼠，60只，體質量17～20g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SYXK（川）K2020-030，合格證號為51203500017366。飼養環境為溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，明暗交替（12h/12h）。動物實驗經云南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，動物倫理審查編號為R-06202009。

1.2  方法

分組、造模與給藥：按隨機數字表法將60只KM小鼠分為陰性對照組、模型組、銀翹散組、DNaseⅠ組，各15只。銀翹散組小鼠灌胃給予銀翹散（按生藥和體質量計72.54g/kg），陰性對照組、模型組、DNaseⅠ組小鼠均灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續3 d。造模前均禁食不禁飲8 h。末次給藥30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定于手術板上，頸部皮膚消毒，縱向切開，剝離皮下組織，暴露氣管，于氣管內滴注脂多糖生理鹽水溶液（5mg/kg），陰性對照組同法滴注等體積生理鹽水。隨后立即直立小鼠，上下輕度晃動數次，使脂多糖均勻分布于肺部，DNaseⅠ組小鼠滴注脂多糖10min后再同法滴注DNaseⅠ（5mg/kg），縫合傷口，待小鼠自然清醒。

指標觀察及檢測：1）肺濕/干重比（W/D）。模型復制6h后處死小鼠，無菌條件下迅速取出肺組織。取左肺上葉，準確稱定質量并記錄濕重（W），放入恒溫80℃干燥箱中烘烤72h，稱定質量，并記錄干重（D），計算W/D。2）肺組織形態。取右肺中葉，用10%多聚甲醛固定48h，脫水，浸蠟，石蠟包埋，制成4μm薄片，用蘇木精-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察。3）MPO和CitH3的表達水平。取右肺上葉，采用蛋白免疫印跡法檢測MPO和CitH3的表達水平；取左肺中葉，采用免疫熒光法檢測MPO和CitH3的熒光表達水平。

1.3  統計學處理

采用SPSS10.0統計學軟件分析。計數資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhane's法。P<0.05為差異有統計學意義。

2.1  肺組織W/D

與陰性對照組比較，模型組小鼠肺組織W/D顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，銀翹散組W/D顯著降低（P<0.05）。詳見表1。

2.2  肺組織病理形態學變化

陰性對照組小鼠肺泡結構完整，支氣管和血管周圍未見明顯炎性變化；模型組小鼠肺毛細血管通透性增高，肺部水腫，肺組織間隙可見大量中性粒細胞浸潤和紅細胞滲出；銀翹散組和DNaseⅠ組小鼠肺組織病變均較模型組減輕，氣道周圍及肺組織炎性細胞浸潤減輕。詳見圖1。

2.3  肺組織中MPO和CitH3免疫熒光表達

與陰性對照組比較，模型組小鼠MPO和CitH3的熒光表達水平均升高；與模型組比較，銀翹散組小鼠MPO和CitH3的熒光表達水平均下降。詳見圖2。

2.4  肺組織中MPO和CitH3的蛋白表達水平

與陰性對照組比較，模型組小鼠肺組織中MPO和CitH3表達水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，銀翹散組小鼠肺組織中MPO和CitH3表達水平均顯著降低（P<0.05）。詳見圖3。

ALI是由多種誘因引起的以急性、進行性呼吸功能不全為特點的常見臨床危重癥，嚴重時表現為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ALI/ARDS由直接或間接的過度肺部損傷和全身性炎性反應引起，其中NETs發揮了重要作用。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的呼吸道疾病，可能發展為ARDS。COVID-19感染患者氣道腔內的NETs，促進血纖蛋白沉積和微血栓形成，阻塞肺泡和細小血管，導致氣管堵塞和肺通氣障礙。COVID-19嚴重感染患者的肺中存在多個廣泛分布的NETs浸潤區域，NETs通過促進纖維細胞的分化，從而加重肺部纖維化。中性粒細胞形成NETs，可增強其直接殺滅或間接干擾病原體擴散的作用，阻止上呼吸道感染的進一步發展。但過度激活的中性粒細胞在肺部形成大量的NETs，會直接加劇肺組織的損傷，推動呼吸道感染的惡化進程。

CitH3的生成可反映NETs水平。組蛋白瓜氨酸化后，核小體中組蛋白和DNA間的緊密靜電結合被削弱，隨后DNA骨架解螺旋，NETs形成。而組蛋白在體內外均可對上皮細胞產生細胞毒性作用，加重ALI癥狀。MPO可導致體外肺上皮和內皮細胞死亡，表明MPO對肺泡-毛細血管屏障有直接毒性作用，其表達也可反映NETs水平。本研究中模型組小鼠肺組織中NETs水平較高，且肺組織炎性細胞浸潤嚴重，可能是NETs中MPO與CitH3等對肺組織的損傷造成的。中醫認為，ALI主要由肺部損傷以致肺失宣降、郁熱內生，影響水液的輸布和排泄導致。銀翹散主要由金銀花、連翹、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等組方，具有疏散風熱、辛涼宣散、清熱解毒、開宣肺氣、止咳等功效。本研究結果顯示，銀翹散可緩解ALI模型小鼠肺部炎癥的滲出和水腫，且小鼠肺組織中NETs形成相關蛋白MPO和CitH3表達水平均降低，提示銀翹散可能通過抑制NETs的形成而減輕ALI，但其具體作用機制還需進一步研究。